海洋放线菌Nocardiopsis sp. SCSIO 11492的抗

恶性肿瘤已经成为全球最主要的公共健康问题之一，肿瘤细胞的耐药性是目前癌症治疗面临的主要问题[1]，这就迫切需要寻找新的抗肿瘤活性成分。据统计，临床上使用的小分子药物中，有60%以上来自于天然产物及其衍生物[2]。目前，已知的抗生素中约有75%来源于放线菌[3]，说明放线菌是一种非常重要的药源性微生物，是发现先导化合物的重要源泉[4]。海洋放线菌生活在高压、高盐、黑暗、寡营养、低温的特殊环境下，其细胞体内往往具有不同于陆地微生物的特殊的代谢途径[5]。从海洋放线菌中分离得到的次级代谢产物具有很好的抗肿瘤、抗菌、抗感染、抗氧化等生物活性，化合物类型丰富，包括萜类、聚酮类、生物碱类、酚类等[6-8]。

为了从海洋放线菌中得到抗肿瘤活性成分，本课题组前期对不同来源的海洋放线菌进行了不同培养基的发酵筛选，发现Nocardiopsis sp. SCSIO 不仅具有丰富的化学成分并且表现出显著的抗肿瘤活性。为了寻找发现其中的活性成分，本文对该株菌进行了大规模发酵，采用不同的分离纯化手段得到8个化合物，通过活性测试，最终找到活性次级代谢产物。

1 仪器与试药

1.1 仪器与材料

Burker-ARX-500 型核磁共振仪(德国Bruker公司)；API 2000质谱仪(美国 AB 公司)；LC3050型制备型高效液相色谱仪(北京创新恒通公司)；ZF-6紫外分析仪(上海嘉鹏科技)；N-1100D-W旋转蒸发仪(日本东京理化公司)；YXQ-LS-SⅡ全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅；GZX-250BS恒温培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；SW-CJ-1F洁净工作台(苏净集团安泰公司)；HYG-B双层恒温摇床(苏州太仓公司)。

柱色谱硅胶(烟台江友硅胶有限公司);Sepha-dex LH-20凝胶(40～70 μm，Amersham Pharmacia公司)；葡萄糖、可溶性淀粉(天津市大茂化学试剂厂)；细菌学蛋白胨、酵母提取粉、琼脂、牛肉浸膏(广东环凯微生物科技有限公司)。

1.2 菌株

海洋放线菌菌株Nocardiopsis sp. SCSIO 分离自海南省三亚市西南端鹿回头半岛岸礁的鹿角珊瑚属样品，株菌的16SrRNA 序列与模式菌株Nocardiopsis flavescens SA6(T)GU的相似度达到了100%，鉴定为拟诺卡氏菌Nocardiopsis sp. SCSIO 。该菌株由中国科学院南海海洋研究所合作提供，标本保存于中国科学院南海海洋研究所(保藏号：SCSIO )。

1.3 培养基

可溶性淀粉：15 g/L，大豆粉：5 g/L，蛋白胨：15 g/L，甘油：15 g/L，CaCO3：2 g/L，3%海水，pH 7.4。

1.4 细胞

RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、A549(人肺腺癌细胞)均购自中国科学院上海生化细胞所。

2 菌株发酵和次级代谢产物分离

2.1 菌株的发酵与提取

将培养皿上活化的海洋放线菌Nocardiopsis sp. SCSIO 的单菌落接入规格为250 mL 的锥形培养瓶中(每瓶装30 mL液体培养基)，28 ℃、200 r/min培养2 d，制备种子液。将种子培养液以5%(体积分数)的接种量接入1 000 mL 的锥形培养瓶中(每瓶含300 mL 的发酵培养基)，共80 瓶，28 ℃、200 r/min振荡培养8 d，得到24 L发酵液。将发酵液由 16 层纱布过滤，分为上清液和菌丝体。取上清液用相同体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，萃取液减压蒸干。菌丝体用80%丙酮水溶液超声破碎提取3次，合并提取液，减压浓缩至不含丙酮后，用乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压蒸干。经TLC检测对比，发现两部分成分相似，最终得到该菌株萃取物的总浸膏(5 g)。

2.2 次级代谢产物的分离

将上述5 g总浸膏采用正相硅胶中压柱色谱(100～200目)，以三氯甲烷-丙酮系统(0%→100%)梯度洗脱，得到3个组分()。组分Fr.1通过ODS反相硅胶中压柱色谱(MeOH-H2O梯度洗脱)得到3个组分，其中组分Fr.1-2和Fr.1-3经Sephadex LH-20凝胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇，体积比1∶1)洗脱得到化合物1(20.1 mg)、2(10.9 mg)和3(13.5 mg)。组分Fr.2通过ODS反相硅胶中压柱色谱(MeOH-H2O梯度洗脱)得到3个组分，其中组分Fr.2-1采用Sephadex LH-20凝胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇，体积比1∶1)洗脱得到化合物4(22.1 mg)、6(10.1 mg)。组分Fr.2-2用相同的方法得到化合物5(6.4 mg)。组分Fr.3依次通过Sephadex LH-20凝胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇，体积比1∶1)洗脱，再经过正相硅胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇，体积比20∶1)纯化，最终得到化合物7(5.6 mg)和8(13.5 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末；易溶于甲醇；1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δ:8.32(1H,s,H-8),8.17(1H,s，H-2),6.42(1H,dd，J=7.9,6.1 Hz,H-1′),4.58(1H,dt,J=5.8,2.5 Hz,H-3′),4.07(1H,m,H-4′),3.84(1H,dd,J=12.3,3.0 Hz,H-5′a),3.75(1H,dd,J=12.3,3.4 Hz,H-5′b),2.80(1H,ddd,J=13.4,8.0,5.8 Hz,H-2′a),2.43(1H,ddd,J=13.4,6.0,2.6 Hz,H-2′b)。13C-NMR(CD3OD,125 MHz)δ:157.5(C-6),153.5(C-2),149.9(C-4),141.6(C-8),120.8(C-5),89.9(C-1′),87.1(C-4′),73.1(C-3′),63.7(C-5′),41.5(C-2′)。以上数据与文献[9]报道一致，故鉴定化合物1为2′-脱氧腺苷(2′-deoxyadenosine)。

上一篇：海洋药物一二三
下一篇：没有了